DTT也常常被用于蛋白質中二硫鍵的還原，可用于阻止蛋白質中的半胱氨酸之間所形成的蛋白質分子內或分子間二硫鍵。但DTT往往無法還原包埋于蛋白質結構內部（溶劑不可及）的二硫鍵，這類二硫鍵的還原常常需要先將蛋白質變性（高溫加熱或加入變性劑，如6M ***胍、8M 尿素或1% SDS）。反之，根據DTT存在情況下，二硫鍵還原速度的不同，可以判斷其包埋程度的深淺。

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